铁死亡功能酶系列|ROS生产者：NOXs

在往期内容中我们介绍了铁死亡的发生机制，铁死亡作为受严格调控的细胞死亡形式之一，其核心机制在于铁积累和脂质过氧化，铁的积累导致细胞内活性氧（ROS）的生成，进而引发脂质过氧化，破坏细胞膜结构，最终导致细胞死亡。而铁死亡的主要诱因包括Fenton反应、线粒体ROS的生成和NADPH氧化酶（NOX）介导的ROS生成等。本期内容我们主要分享与ROS产生密切相关的NOX家族的故事。

一、ROS与铁死亡间的关联

在认识NOX家族之前，我们先了解一下NOX介导生成的产物ROS的定义及功能。ROS是指由氧衍生的小分子物质，包括氧自由基如超氧（O2-）、羟基（•OH）、过氧（RO2•）、烷氧基（RO•）和某些非自由基。ROS可以与无机分子、蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸等生物大分子形成密切的相互作用进而不可逆地破坏或改变靶分子的功能。因此，ROS是生物机体损伤的主要贡献者这一观点越来越被推崇[1]。铁死亡是一种ROS依赖性的细胞死亡形式，而ROS的主要细胞来源是线粒体代谢和细胞膜上的NADPH 氧化酶（NOX）[2]。

图1. ROS参与铁死亡机制示意图[2]

二、NOX家族成员及结构

作为催化产生ROS的主力军，NOX家族成员最早是在吞噬细胞膜中被发现[3]，其主要作用是通过产生ROS来破坏病原体，是免疫防御的重要角色之一。NOXs在体内各器官/组织中广泛表达，并且根据细胞类型的不同，NOXs的各种同工酶定位在不同的膜上，包括质膜和各种内膜，如内质网、细胞核和线粒体等，是一种典型的膜蛋白。自首次发现至今，已被鉴定的人源NOX家族蛋白包括7种亚型，均为跨膜蛋白，其中NOX1～5是六次跨膜蛋白，DUOX1和DUOX2是七次跨膜蛋白。

NOXs通过生物膜传输电子，将氧气还原成超氧化物。根据这种保守的功能，NOX的所有家族成员具备共有的保守结构特性。从C端开始，这些保守的结构特征包括：① 在最C端有一个NADPH结合位点；② 在C端跨膜结构域附近有一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合区；③ 有六个保守的跨膜结构域；④ 有四个高度保守的血红素结合组氨酸，其中两个位于第三个跨膜结构域，另外两个位于第五个跨膜结构域[1, 4]。

图2. NOX家族成员及结构域示意图[1]

三、NOXs的组装与活化

NOX蛋白本身几乎没有催化活性，它们需要与多种调节亚基结合形成稳定的复合物才能发挥作用。辅因子p22phox是NOX复合物的稳定因子，它与NOX2结合形成一个在558 nm处有强吸收的复合物，被称为黄素蛋白b558。尽管p22phox本身没有催化活性，但对于NOX蛋白复合物的稳定起着重要支撑，是NOX1～4都必需的一个辅助因子。除了p22phox之外，NOX1～3的激活还需要多个调节亚基。如NOX2在未激活状态下，p40phox、p47phox和p67phox三个调节亚基以一个复合物的形式存在于细胞质中。接收到激活刺激后，p47phox会被磷酸化，整个复合物会迁移到细胞膜与膜上的黄素蛋白b558结合，形成一个酶复合物。此外，NOX1～3的催化活性对于小分子GTP酶如Rac1与Rac2表现出不同程度的依赖性。一旦组装完成，该复合物就具有活性，并通过将细胞质溶胶中NADPH的电子转移到腔内或细胞外空间的氧气中来产生超氧化物，完成氧化过程[5, 6]。

图3. NOX2的组装及活化示意图[1]

四、NOXs的生物学功能及其与铁死亡的关系

NOXs是体内ROS的主要来源，也是唯一直接产生ROS的酶。NOX催化产生的ROS在许多生理学过程中都起着重要作用。首先是最早发现的免疫防御过程，通过产生ROS灭活细菌毒力因子，清除病原体并参与抗炎反应。同时，NOX在NET（中性粒细胞胞外诱捕网）激活中发挥作用，在免疫和炎症过程中具有关键作用。其次，NOXs催化产生的ROS通过过氧化氢（H2O2）参与细胞的氧化还原信号传导，包括调节钙离子、调控信号通路、抑制磷酸酶和激酶的活化等，调控多种细胞生命过程，包括细胞死亡[1]。细胞死亡在生物体的发育和稳态维持中起着关键作用。不同形式的细胞死亡一直是生物医学研究的热点，其中“新晋热门选手”铁死亡的机制也得到了很大程度的解析。ROS是铁死亡的重要参与者，那ROS的生产者NOXs与铁死亡又有什么样的关系呢？

图4. 铁死亡过程中的NOXs[7]

近年来，NOX家族成员陆续被发现参与铁死亡过程，其中有三个NOX家族成员（NOX1、CYBB/NOX2和NOX4）已被证明通过不同的调节机制促进细胞铁死亡进程。

NOX1在p53蛋白（TP53基因编码）的调控下与二肽基肽酶4（DPP4）结合介导质膜脂质过氧化反应进而促进细胞铁死亡，因此作为铁死亡的正向调控因子，NOX1是铁死亡检测的标志物之一（图5A）[8]；

在卵巢癌的相关研究中，细胞密度“传感器”Hippo通路效应物TAZ调控血管生成素样4（ANGPTL4）转录继而激活NOX2，导致细胞对铁死亡的敏感性增强（图5B）[9]；

活化的EGFR（EGFR*）可刺激MAPK信号传导，诱导NOX4的表达，而NOX4催化NADPH产生的H2O2与铁（Fe2+）进一步反应产生羟基自由基，引发脂质过氧化，最终导致膜完整性的丧失，促进以细胞膨胀和破裂为特征的铁死亡（图5C）[10]；

另外，上皮膜蛋白1（EMP1）介导的丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）亦可调控癌细胞中NOX4的表达促进脂质过氧化进而促进细胞铁死亡[11]。

在铁死亡的相关研究中，NOX1/NOX4 抑制剂（GKT137831）已经被证实能够显著抑制铁死亡及其在细胞间的传播速度[12]。

图5. NOXs参与细胞铁死亡的机制[6-8]

“铁死亡”的概念首次被提出的时间是2012年，仅10余年时间内，与之关联的高分文章层出叠现，显示出巨大的研究潜力。学者们对于上下游分子及其在各类疾病中的机制探索热情空前高涨。本期内容主要为大家介绍了NOX家族成员的概况及其在铁死亡过程中的作用，作为影响细胞对铁死亡敏感性的重要因素之一，NOXs影响铁死亡的上游调控机制在各类疾病中显示出复杂的多样性，相关抑制剂的研究对于由其介导的铁死亡相关的疾病预防或治疗具备重要意义。

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参考文献：

[1] Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007 Jan;87(1):245-313.

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[4] Lambeth JD. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat Rev Immunol. 2004 Mar;4(3):181-9. 

[5] Vermot A, Petit-Härtlein I, Smith SME, Fieschi F. NADPH Oxidases (NOX): An Overview from Discovery, Molecular Mechanisms to Physiology and Pathology. Antioxidants (Basel). 2021 Jun 1;10(6):890. doi: 10.3390/antiox10060890. PMID: 34205998; PMCID: PMC8228183.

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[12] Co HKC, Wu CC, Lee YC, Chen SH. Emergence of large-scale cell death through ferroptotic trigger waves. Nature. 2024 Jul;631(8021):654-662.