Cardiovasc Res | 广州医科大学朱东兴团队重磅发现！主动脉瓣钙化的关键“开关”——ALKBH5

钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是一种常见且临床后果严重的心脏瓣膜疾病，但其发病机制尚未完全明确。过往CAVD被认为是瓣膜退化和钙沉积导致的被动过程，现阶段研究发现其实是与生理性骨矿化相似的主动调节过程。主动脉瓣间质细胞（VIC）作为主动脉瓣中的主要细胞类型而起着关键作用，健康时处于静止状态，在病理条件下会引发一系列病变反应。重要的是，VIC向成骨样细胞转化是主动脉瓣钙化的基本特征。因此，将向成骨样细胞转化的VIC恢复为静止状态可能是减轻或逆转CAVD的有效手段。近年来，越来越多证据表明表观遗传学调控在CAVD的发展中至关重要，其中m6A甲基化修饰在CAVD中的功能尚未得到关注。

图片.主动脉瓣钙化的关键“开关”——ALKBH5

2024年12月10日，广州医科大学朱东兴教授团队在《Cardiovascular Research》（IF=10.2）上发表题为“The N6-methyladenosine demethylase ALKBH5 is a novel epigenetic regulator of aortic valve calcification”的研究论文。本研究结合CAVD患者的临床样本与人瓣膜间质细胞（hVIC）钙化模型，筛选了其中m6A调控因子的表达变化，发现关键m6A去甲基化酶ALKBH5表达显著下调，同时m6A水平升高。接着使用m6A修饰抑制剂3-脱氮腺苷（DAA）处理hVIC钙化模型，hVIC成骨分化和钙化均得到显著改善。随后，进一步在hVIC钙化模型中沉默或过表达ALKBH5，并在模型发展的不同时间（造模第7天和第14天）探讨ALKBH5的影响和作用机制。研究结果发现，ALKBH5通过调节TGF-β信号通路抑制CAVD的发展。ALKBH5直接下调TGFBR2 mRNA的m6A水平，增加其不稳定性而被降解，进而下调SMAD2的磷酸化水平，并减轻了hVIC钙化模型的成骨分化和钙化状态。本研究证实了hVIC中m6A甲基化水平升高会促进CAVD的发展，ALKBH5表达在其中发挥着关键作用，表明ALKBH5或可作为治疗CAVD的潜在靶点。

本研究中，1066vip威尼斯生物有幸为作者提供了ALKBH5过表达腺病毒，并在hVIC钙化模型中成功实现ALKBH5的高表达。

下面我们一起来看看作者是如何发掘其中的机制：

1. ALKBH5在钙化的hVIC和人主动脉瓣中表达下调

作者为探究m6A修饰在CAVD发病机制中的潜在作用，检测了体外hVIC钙化过程中m6A调控因子的表达情况，发现ALKBH5的mRNA和蛋白水平均持续下降，且钙化的hVIC中整体m6A修饰水平显著增加（图1 A-D）。在CAVD患者的临床样本中，主动脉瓣钙化区ALKBH5的mRNA和蛋白表达下调，且从钙化区分离的hVIC也是如此（图1 E-J）。此外，瓣膜炎症是CAVD早期的主要特征，用炎症细胞因子IL-1β处理显著降低了hVIC中ALKBH5的表达（图1 K）。结果表明，ALKBH5表达下调与瓣膜炎症和CAVD发病机制有关。

图1. ALKBH5在CAVD中表达下调

2. 沉默ALKBH5加剧体外hVIC的成骨分化和钙化

为评估ALKBH5在CAVD中的潜在功能，作者先使用含抗坏血酸和无机磷酸盐的钙化培养基诱导hVIC体外钙化模型进行后续研究。结果显示，经m6A抑制剂DAA处理后，hVIC的钙化程度显著降低，同时BMP2表达明显减少（图2 A-D）。在对照与钙化两种条件下，采用siRNA方式沉默ALKBH5基因的表达，均导致hVIC中整体m6A水平显著上升，BMP2和MSX2的表达水平也随之升高。在钙化条件下，第14天的钙沉积显著增加（图2 E-L）。相反，通过腺病毒介导ALKBH5过表达，hVIC的整体m6A水平降低，钙沉积减少，且BMP2的mRNA水平以及MSX2的蛋白水平均出现下调（图S7）。结果表明，ALKBH5介导的m6A修饰可能在体外抑制hVIC的成骨分化和钙化。

图2. 沉默ALKBH5可促进体外hVIC成骨分化和钙化

图S7. 过表达ALKBH5抑制了hVIC在体外的成骨分化和钙化

3. 沉默ALKBH5可促进hVIC和hVEC的炎症反应

除了对成骨分化和钙化的影响，炎症在CAVD发展中同样至关重要。因此，作者进一步研究了ALKBH5对瓣膜炎症的调节作用。结果发现，在对照处理和造模处理的第7天，沉默ALKBH5显著增加了hVIC中炎症因子TNF-α、IL-1β和ICAM1的mRNA水平（图3 A-C）。而过表达ALKBH5则显著下调了IL-1β和ICAM1的mRNA表达以及ICAM1的蛋白表达，但TNF-α的mRNA水平未受影响（图3 D-H）。此外，敲低人瓣膜内皮细胞（hVEC）中的ALKBH5，在第7天会显著增加IL-1β的mRNA和蛋白表达（图3 I-K）。结果表明，ALKBH5在瓣膜炎症中具有潜在作用。

图3. ALKBH5调节瓣膜炎症 

4. ALKBH5调控hVIC中的TGFBR2/SMAD2信号通路

接着，作者继续研究了ALKBH5抑制hVIC成骨分化和钙化的潜在机制。有研究表明，TGF-β信号通路在CAVD发生发展过程中起着关键作用[1]。与先前报道一致，在hVIC钙化过程中，TGF-β1的mRNA和蛋白水平以及TGFBR2的mRNA水平显著增加（图S8）。进一步研究结果发现，沉默ALKBH5会在第7天显著增强hVIC中TGFBR2的mRNA和蛋白表达，以及 SMAD2的磷酸化水平；过表达ALKBH5则效果相反（图4 A-K）。并且，与非钙化的主动脉瓣组织相比，钙化主动脉瓣组织及从钙化区域分离的hVIC中，TGFBR2蛋白表达显著增加（图4 L）。结果表明，TGFBR2/SMAD2信号通路可能是ALKBH5抑制hVIC成骨分化和钙化的作用机制。

图S8. ALKBH5不会改变hVIC中TGFβ1和TGFBR1的表达

图4. ALKBH5调控hVIC中的TGFBR2/SMAD2信号传导

5. ALKBH5通过TGFBR2/SMAD2信号通路调节hVIC的成骨分化和钙化

为探讨ALKBH5是否通过TGFBR2/SMAD2信号通路调节hVIC的成骨分化和钙化。在hVIC钙化培养条件下加入TGFBR1/2抑制剂LY2109761，结果显示，在第14天时，因ALKBH5缺失所导致的钙沉积得到显著缓解，同时BMP2和MSX2的mRNA与蛋白表达水平均下调（图5 A-G）。此外，采用siRNA敲低SMAD2基因表达后，同样抑制了因ALKBH5缺失引发的hVIC钙沉积（图5 H, I）。在第7天的检测中发现，MSX2的mRNA表达水平显著降低，而BMP2的mRNA表达上调情况未受明显影响（图5 J, K）。这些结果表明TGFBR2/SMAD2信号通路介导了ALKBH5对hVIC成骨分化和钙化的抑制作用。

图5. ALKBH5通过TGFBR2/SMAD2信号传导调节hVIC的成骨分化和钙化

6. ALKBH5直接调控hVICs中TGFBR2 mRNA的m6A水平及稳定性

为明确ALKBH5调节hVIC中TGFBR2/SMAD2信号的潜在机制，作者先通过计算机模拟，预测了TGFBR2、BMP2和MSX2 的mRNA中潜在的m6A修饰位点。随后，通过MeRIP-qPCR分析显示，过表达ALKBH5显著降低hVIC中TGFBR2和BMP2 mRNA的m6A水平，而MSX2未出现明显变化；相反，当沉默ALKBH5后，三者的m6A水平均显著升高（图6 A-G）。进一步研究发现，过表达ALKBH5可促进TGFBR2和BMP2的mRNA降解，但MSX2的mRNA水平不受影响（图6 H-J）。综合以上结果可推断，ALKBH5可能直接对TGFBR2和BMP2的mRNA进行m6A修饰调节，进而改变hVIC中的TGFBR2/SMAD2信号通路的作用。

图6. ALKBH5直接调节hVIC中TGFBR2和BMP2的m6A水平

7. YTHDF1介导ALKBH5敲低后hVIC的成骨分化和钙化

m6A修饰依赖于阅读蛋白对其识别并发挥功能。因此，作者进一步探讨了m6A阅读蛋白YTHDF1/2/3在由沉默ALKBH5所诱导的hVIC成骨分化和钙化中的潜在作用。结果发现，在第2天，仅当敲低YTHDF1时，hVIC中TGFBR2和BMP2的mRNA及蛋白表达水平显著降低（图7 A-E）。同时，在hVIC体外钙化过程中，YTHDF1 mRNA水平显著上调（图7 F）。值得注意的是，在钙化条件下的第14天，敲低YTHDF1显著减少因ALKBH5表达缺失而增加的hVIC钙沉积（图7 G）。并且，在第7天，敲低YTHDF1显著下调了沉默ALKBH5诱导的TGFBR2、BMP2和MSX2的mRNA表达，BMP2蛋白表达下调，MSX2蛋白无明显变化（图7 H-L）。这表明YTHDF1在ALKBH5介导的对hVIC成骨分化和钙化的抑制作用中起关键作用。

图7. 敲低ALKBH5后，YTHDF1可在体外介导hVIC成骨分化和钙化

综上所述，m6A去甲基化酶ALKBH5通过TGFBR2/SMAD信号通路，以m6A修饰方式负向调节hVIC成骨分化和体外钙化，在CAVD中起关键保护作用，有望成为治疗CAVD的潜在靶点，为开发治疗CAVD的新策略提供了理论依据。

图形摘要. ALKBH5在CAVD中的潜在作用机制

参考文献

[1] Chakrabarti M, Bhattacharya A, Gebere MG, et al. Increased TGFβ1 and SMAD3 Contribute to Age-Related Aortic Valve Calcification. Front Cardiovasc Med. 2022;9:770065.