Nature子刊丨纳米点包裹的自噬体强效癌症疫苗——癌症治疗新突破！

癌症疫苗能引发癌症特异性免疫反应，被认为是具有潜力的免疫治疗策略。近年来，研究人员已开发基于使用癌细胞裂解液、外泌体或基于肿瘤的微泡来递送肿瘤抗原的方法，虽然这些方法可延长无进展生存期，但其免疫原性较弱，抗原呈递效率较低，难以有效诱导免疫反应。因此，构建具有高免疫原性、高效交叉呈递、适合内吞作用的癌症疫苗仍是一个巨大的挑战。与外泌体、微泡等相比，自噬体可隔离多种肿瘤抗原、热休克蛋白、缺陷型核糖体产物等，具有激活先天与适应性免疫反应的出色能力，此外，自噬体的大小既适合抗原呈递细胞的吞噬，又能有效触发肿瘤特异性免疫反应。目前还没有获得高免疫原性自噬体癌症疫苗的有效方法，在肿瘤中原位生成自噬体疫苗成为了极具前景但也充满挑战性的研究课题。

近日，中国科学技术大学尤业字、洪春雁、王龙海、肖峻及陈光作为共同通讯作者在《Nature Nanotechnology》（IF=38.1）在线发表题为“Autophagosomes coated in situ with nanodots act as personalized cancer vaccines”的研究论文，在这项研究中，作者首先制备了针对磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）有独特结合能力的功能性Ti2NX纳米点，它可捕获和包裹自噬体，并形成稳定的纳米点包被自噬体（nanodot-coated autophagosome，NCAP），免疫荧光和透射电镜观察到NCAP与溶酶体或多泡体（multivesicular bodies，MVBs）的进一步融合会被阻断，导致NCAP积累，引发细胞焦亡和膜破裂，最终NCAP逸出，使得研究人员能轻松制备NCAP。随后，作者在体外实验和小鼠癌症模型中验证了NCAP能激活免疫细胞并触发有效的免疫反应，消除原发性和远端肿瘤，并能为治愈个体提供长期免疫监视保护。这项工作提供了一种在体内直接形成个性化自噬体癌症疫苗的方法，为肿瘤治疗提供了一种极具前景的策略。在此研究中，作者使用了1066vip威尼斯生物提供的自噬双标腺病毒（HBAD-mRFP-EGFP-LC3）用来判断自噬体以及自噬溶酶体的形成。

图1. 自噬体原位包被纳米点作为个性化癌症疫苗的方案

下面，我们一起来看看本文的主要研究内容：

1.Ti2NX纳米点捕获和包裹自噬体以产生稳定的NCAP

首先，作者通过对多层Ti2AIN进行逐步蚀刻和剥离，制备了尺寸为3 nm的功能性Ti2NX纳米点，这些纳米点对PI4P具有独特的结合能力。为了确定Ti2NX纳米点处理后是否能阻断自噬体与溶酶体融合，作者将自噬双标腺病毒（HBAD-mRFP-EGFP-LC3）转染到癌细胞中，发现和PBS组相比，在Ti2NX纳米点处理后，观察到更多黄色斑点，而只有少数红色斑点，表明Ti2NX纳米点处理后，自噬体和溶酶体的融合被成功阻断。另外，利用透射电镜也观察到在Ti2NX纳米点处理后，自噬体与溶酶体/MVBs融合更少。

通常，自噬体即使不与溶酶体融合，也很难从肿瘤细胞中逸出，但如果想作为癌症疫苗发挥作用，必须具备轻易从癌细胞中逃逸出的能力。透射电镜观察显示，在癌细胞与纳米点共孵育后，大多数NCAP出现在细胞外空间，这表明形成的NCAP能成功从癌细胞中逸出。一般来说，自噬会将各种受损的细胞器和细胞废物运送到溶酶体或MVBs进行降解，以维持细胞内稳态，当自噬体的融合被阻断时，内容物既不能被降解也不能被排出细胞外，从而增加了细胞内应激水平。WB结果显示，Ti2NX纳米点处理后，NLRP3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3）炎症小体被激活，进而触发细胞焦亡，导致细胞膜破裂，NCAP流出细胞，从而可以通过简单的离心过程就可以轻松分离出NCAP。

图2. Ti2NX纳米点捕获和包裹癌细胞自噬体以产生稳定NCAP的能力

2.NCAP在淋巴结中积累并激活免疫细胞

NCAP向淋巴结的转运以及与抗原呈递细胞的相互作用对随后的免疫激活至关重要，所以，作者采用体外同种异体干细胞（allogeneic cells）制备NCAP疫苗（Allo-NCAP），使用CFDA荧光标记Allo-NCAP，并对Allo-NCAP疫苗在淋巴结内的浸润情况进行评估。结果发现在皮下注射Allo-NCAP 120 h后，淋巴结内仍观察到强烈的荧光，而主要器官内几乎没有荧光。为进一步确定Allo-NCAP是否能转运至淋巴结以激活局部的树突状细胞（DCs）和T细胞，作者通过流式细胞术评估了淋巴结中的CFDA信号，与由氯化铵和硼替佐米制备的自噬体（Drip-AP）相比，Allo-NCAP进入DCs的能力更强，且浸润Allo-NCAP的CD8+T细胞比例和CD4+T细胞比例分别比Drip-AP高出1.9倍和1.5倍，因此，Allo-NCAP具有更强的向T细胞交叉呈递抗原的能力，并有可能触发T细胞介导的免疫反应。通常，常驻树突状细胞只能摄取被动转运至淋巴结的抗原，而迁移的树突状细胞则可以摄取抗原并随后引流至淋巴结，作者分别统计了皮下注射两种自噬体疫苗后相关免疫细胞在淋巴结中的分布比例，与Drip-AP相比，注射Allo-NCAP组的迁移树突状细胞比例大约高出106%，表明与Drip-AP相比，Allo-NCAP具有被迁移树突状细胞识别的优越能力。因此，NCAP容易被迁移的树突状细胞识别，并进一步转运至淋巴结，向T细胞释放抗原。

为了确定Allo-NCAP是否能在体外激活免疫细胞，作者提取了骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），与CFDA标记的Allo-NCAP共同孵育，结果显示，BMDCs能有效摄取Allo-NCAP，并能分解释放所负载的免疫刺激因子和肿瘤抗原，这极大地促进了BMDCs的成熟。随后，作者评估了Allo-NCAP接种荷瘤小鼠后淋巴结的成熟情况，对小鼠的腹股沟淋巴结进行分离和染色，发现Allo-NCAP组的淋巴结比其他组大得多，并且含有更多的免疫细胞，表明Allo-NCAP可有效转运至淋巴结，在淋巴结内发挥免疫刺激作用。

图3.NCAP被抗原呈递细胞识别，并被有效地运输至淋巴结以激活免疫细胞

3.Self-NCAP疫苗触发有效的免疫反应

由于外源性异体肿瘤生产的Allo-NCAP不含有患者特异性的肿瘤抗原，导致特异性免疫效应有限，所以作者将Ti2NX纳米点直接注射到小鼠肿瘤中，纳米点可以在体内捕获肿瘤中的自噬体，在体内肿瘤组织中产生自体NCAP疫苗（self-nanodot-coated autophagosome，Self-NCAP），后续作者用LC3B标记和透射电镜证实了肿瘤中Self-NCAP的产生，并可进一步转运至淋巴结。接着，作者评估了Self-NCAP的抗肿瘤能力，发现Self-NCAP的肿瘤治疗效果明显优于传统的自噬体和Allo-NCAP。然后，作者在双侧4T1和双侧CT26肿瘤模型中评估了Self-NCAP是否能消除远端肿瘤，分别用Ti2NX纳米点、阿霉素（DOX）、顺铂和NLRP3诱导剂—BMS-986299对原发肿瘤进行治疗，发现Self-NCAP组的原发肿瘤和远端肿瘤都高度消退，而其他组仅抑制肿瘤生长。

由于肿瘤消除依赖于杀伤性T细胞，因此，作者评估了Self-NCAP治疗后淋巴结内IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例，结果发现，相比PBS组，Self-NCAP组激活了更高比例的IFN-γ+ CD8+ T细胞，进一步评估外周血中CD8+ T细胞数量，Self-NCAP组中有64%的IFN-γ+ CD8+ T细胞，而PBS组仅有10%，表明激活的淋巴结驻留 T 细胞进入血管以浸润远处肿瘤。此外，在Self-NCAP疫苗处理后，原发肿瘤和远端肿瘤均被CD8+ T细胞浸润，因此，通过纳米点在体内肿瘤中原位生成Self-NCAP的策略在免疫激活方面很有前景，比通过直接杀死肿瘤细胞释放抗原的效果更好。

图4.体内Self-NCAP疫苗的原位制备及其抗肿瘤能力

4.Self-NCAP疫苗可提供长期的免疫监视

接下来，作者检测了Self-NCAP激活的免疫反应是否具有肿瘤特异性以及激活的免疫反应是否可以发展为免疫记忆，为治愈小鼠提供长期保护。结果发现，Self-NCAP 激活的强大免疫反应可逆转肿瘤免疫抑制微环境，表现为肿瘤内 Foxp3+ CD4+ 调节性T细胞显著减少，而CD8+和CD4+T细胞浸润增加，且更多的CD8+T细胞能表达IFN-γ。此外，在小鼠CT26结肠癌模型中，Self-NCAP 对肿瘤的治疗效果显著，治愈率达100%，且在很长一段时间内肿瘤不复发，治愈的小鼠在57天后再次皮下注射CT26肿瘤细胞也不会复发肿瘤，表明Self-NCAP触发的免疫反应能提供长期保护，同时，治愈小鼠外周血单核细胞中的效应记忆T细胞比对照组多四倍，说明Self-NCAP疫苗可引发长期免疫记忆效应，为治愈的小鼠提供长期免疫监视。

图5. Self-NCAP疫苗可触发肿瘤特异性免疫反应，并提供长期抗肿瘤保护

总结

综上所述，本研究开发了一种利用功能性Ti2NX纳米点在肿瘤内原位生成个性化自噬体癌症疫苗（Self-NCAP）的方法。首先，Ti2NX纳米点通过结合自噬体上的PI4P阻断其与溶酶体或MVBs融合，形成NCAP，NCAP的累积增加癌细胞内压力，诱发细胞焦亡并释放NCAP。随后，NCAP被抗原呈递细胞提取，释放免疫刺激因子和肿瘤特异性抗原，激活树突状细胞和CD8+T细胞，从而触发肿瘤特异性免疫反应，消除原发性和远端肿瘤，并能为治愈后的个体提供长期免疫监视保护，防止肿瘤复发，这项技术为肿瘤的根除提供了一种极具前景的研究途径。